Бета – таласемията [OMIM, GeneTests] е едно от най-честите моногенни заболявания в света. В частност бета – таласемията е най-често срещаното генетично заболяване в средиземноморските страни. На някои от средиземноморските острови честотата на хетерозиготите варира между 5 и 20%. Разпространението на таласемия минор е преобладаващо при кипърци (14.7%), гърци (8%), албанци (7.1%) и италианци (3.7%). Честотата на заболяването в България е 2.4%, което означава че 200 000 хиляди българи са носители, 18-20 новородени се раждат с таласемия минор. Болестта се причинява чрез мутации в бета – глобиновия ген, локализиран на 11р15.5 хромозома.

• Методи за молекулярен анализ [GeneTests]

Мутационите анализи на семейства с бета–таласемия се извършват чрез директно секвениране на целия бета-глобинов ген.

• Молекулярни характеристики на българските популации

В българската популация бяха намерени 22 мутации, причиняващи бета – таласемия. Ние намерихме 17 от тях, а други 5 са съобщени от Петков и съавт. Идентифицираните мутации отговарят на 65.6% от алелите причиняващи заболяване, докато 34.4% от тях са все още неизвестни.
Съгласно нашите резултати, най-често срещаната мутация беше IVS1-110 (22.9%), което важи и за другите балкански популации. Втората по честота мутация в нашата група беше CD39. В Гърция тази мутация също е втора по честота, но тя заема 4-та позиция в Югославия и пета в Турция. Две мутации IVS1-1, IVS1-6 са представени с честота мужду 5-10%. Останалите осемнадесет дефекта са редки, с популационна честота от 5%.

Болестта на Шарко–Мари–Тут (СМТ) [OMIM, GeneTests] е най-честото наследствено заболяване на периферната нервна система. Представлява хетерогенна група от нарушения варирайки в типа на унаследяването и клинична проява. Всички типове на унаследяване са били съобшени, но СМТ е обикновено предавана по доминантен (автозомен или Х – свързан) начин. Най-честата форма е СМТ 1А (70% от всички случаи) и е асоцирана със субмикроскопична (1,5Мb) дуприкация на 17р11.2 регион и съдържа РМР22 гена. Формата СМТ 1В е свързана с хромозома 1q22-q23 и се дължи на точкови мутации в гена МРZ. Мутации в Сх32 гена от хромозома Хq13-q22 са свързани с СМТХ и са често срещани (около 20% от всички СМТ случаи). Досега 4 нови гена (EGR2; MTM2; NDRG1; NF2) са били съобщени като свързани с някои редки автозомно – доминантни и рецисивни типове на СМТ.

• Методи за молекулярен анализ [GeneTests]

Прави се първоначален скрининг за дупликация (делеция) в 17р11 използвайки 3 високо полиморфни маркери D17S921, D17S122, AFM1358 на ABI фрагмент-анализатор. Молекулярния дефект в положителни проби се потвърждава чрез Sothern блот с проби Pew401HE, Pvaw409R1 и PLR7.8. Освен резултатите от Sothern блота, пациенти от всички 59 семейства бяха проверени за точкови мутации в PMP22,MPZ, Cx32 и ERG2 гени използвайки нерадиоактивен SSCP анализ. Проби с абнормален миграционнен профил бяха секвенирани използвайки BigDye кит за секвениране (Perkin Elmer Cetus) за ABI секвенатор.

• Молекулярни характеристики на българските популации

Общо от 104 засегнати индивиди ние намерихме 9 различнии мутации в 3 гена. Най-честият дефект беше дупликация на РМР22 гена, наблюдаван в 30% отСМТ1 случаи. Реципрочната мутация (делеция на РМР22 гена) беше намерена в 4 семейства, където засегнатите индивиди бяха клинично диагностицирани, като имащи наследствена невропатия. Мутации, които са били съобщени преди бяха намерени в MPZ иCx32 гените. Тези резултати демонстрират хетерогенната природа на СМТ при български пациенти. Честотата на мутациите, която ние намерихме беше по-ниска отколкото съобщената от други публикации. В допълнение, в повече от 50% от семействата дефекта причиняващ заболяване е непознат. Това би могло да предполага съществуването на мутации в други вероятно все още неидентифицирани гени.

Изследването е проведено съвместно с:
Laboratory for Neurogenetics, University of Antwerp, Belgium
Department of Molecular Genetics, Baylor School of Medicine, USA

Муковисцидозата [OMIM, GeneTests] е наследствено заболяване засягащо различни органи и функции на човешкото тяло включващи дишането храносмилането и размножаването. Най-честите симптоми са слаб растеж, хронична кашлица, чести бронхопневмонии, инфекции на синусите, назални полипи и солена на вкус кожа. Симптомите и тежестта на заболяването варират значително при различните индивиди. Повечето пациенти имат дихателни и храносмилателни проблеми, но при някои могат да преобладават само дихателните. Муковисцидозата не засяга умственото развитие на индивида. Почти всички пациенти от мъжки пол имат проблеми с фертилитета, които се диагностицират като обструктивна азооспермия. При жените с муковисцидоза също се наблюдават трудности при забременяването. Като правило заболяването се диагностицира в ранна детска възраст. При някои по-леко протичащи форми диагнозата може да бъде поставена в зряла възраст. С годините клиниката се обостря и средната продължителност на живот на пациентите е около 30 години. Освен най-характерните клинични симптоми за поставяне на диагнозата неколкократно се извършва потен тест, който при пациентите показва повишено солево съдържание. В норма стойностите на електролитите в потта са до 40 mM/l Cl, между 40 60 mM/l Cl се считат за гранични, а над 60 mM/l Cl за патология. Стойностите на потния тест не отразяват тежестта или формата на заболяването. Муковисцидозата може да се разгледа като хронично заболяване където редовната терапия и грижи подобряват качеството и продължителността на живота.

• Как се интерпретират резултатите от скрининга за носителство

Дефектите в гена за муковисцидоза са над 1000. Някои от тези дефекти се срещат много често при пациентите с това заболяване, докато други са характерни само за опредени етнически групи или географски райони. Прието е диагностичните лаборатории да могат да идентифицират между 80 - 90 % от характерните за дадената страна дефекти. Най-честите мутации свързани със заболяването при българските пациенти са: delF508, N1303K, G542X, 1677delTA, R347P, R1070Q, 2183 A-G, Q220X, 3849+ 10KB, 4374+1 G-A, G1244V+S912L, G1244E, W1282X, 2184 insA. С този диагностичен панел се покриват около 85% от характерните за България дефекти. Ако изследванията установят молекулни дефекти при Вас и Вашия партньор, при всяка бременност съществува 25% риск за раждане на дете с муковисцидоза. В 50% от бременностите децата ще са здрави "носители", а в 25% здрави не-носители.
Повече информация ца муковисцидозата у нас

• Какво причинява МУКОВИСЦИДОЗА?

Муковисцидозата се проявява защото при пациента не работи нормално една двойка гени. Гените отговарят за нашите физическите особености и биологични функции. Повечето гени имат две копия които ние получаваме от нашите родителите. Когато в гените настъпят промени, това на-често им пречи да функционират нормално. Тези промени се наричат мутации. Ако даден човек носи мутация само върху единия ген отговорен за муковисцидозата мутация, той не развива заболяването, защото другия ген компенсира дефекта. Такива хора се наричат "носители". За да се прояви заболяването трябва да има дефект и върху двата гена.Когато и двамата родители са "носители" при всяка бременност съществуват четири възможни комбинации на гените:



• и двамата родители предават в поколението нормалните гени - тогава се ражда здраво дете, което не е "носител"
• майката предава нормален ген, а от бащата ген който не функционира - ражда се здраво дете "носител"
• бащата предава нормален ген, а майката ген който не функционира - ражда се здраво дете "носител"
• само когато и двамата родители предадат в потомството дефектните гени - тогава се ражда дете с муковисцидоза

Така при всяка бременност има 75% шанс да се роди здраво дете и 25% риск да се роди дете с муковисцидоза.
• Какво означава ако не са установени молекулни дефекти след приключване на анализите?

Тъй като е невъзможно да се гарантира 100% липсата на дефект дори и след най-пълните изследвания, рискът за раждане на дете с муковисцидоза може значително да бъде намелен, но никога се приема за нулев. Рискът да се роди дете с муковисцидоза при различни резултати от генетичния тест може да се изчисли по следната схема:


Двамата партньори са	Риск за дете с муковисцидоза
носители	1:4
единият е носител, другият не е изследван	1:130
единият е носител, другият е негативен*	1:800
двамата не са изследвани	1:3600
единият е неизследван, другият е негативен*	1:26000
и двамата са изследвани-негативни*	1:157000

*изчисленията са на базата на отхвърлени 85% от дефектите след генетичните анализи.

• Какъв е рискът да бъдем "носители"?

Рискът да бъдем "носители" зависи от етническия произход и фамилната история. При много семейства може да няма изявена фамилната история и въпреки това те да са "носители". В Европа приблизително 1:25 човека (4%) са носители. В България "носители" са приблизително 1: 33 човека. Така в приблизително 1 : 900 семейства и двамата родители са "носители" и при тях съществува 1: 4 риск да имат дете с муковисцидоза. Годишно в България 1 : 3600 деца се раждат с това заболяване. При фамилна история на муковисцидоза рискът да бъдеш "носител" се определя от родствената връзка с пациента.

Връзка с пациента	Риск
Дете или родител	1:1 - 100%
Брат или сестра	2:3 - 67%
Племенник или племенница	1:2 - 50%
Вуйчо или леля	1:3 - 33%
Първи братовчеди	1:4 - 25%

Пациенти от мъжки пол с репродуктивни проблеми и диагноза конгенитална билатерална аплазия на vas deferens (CBAVD), както и техни родственици също са вероятни носители на дефект в гена. Ако във вашата фамилия има членове с диагноза муковисцидоза или CBAVD, трябва да уведомите личния лекар за да бъдете насочен за генетични изследвания към специализираната лаборатория.

• Допълнителна информация

Веднага след поставяне на диагноза муковисцидоза цялото семейство трябва да бъде насочено за генетични анализи.
Целта на тези анализи е да подготви семейството за профилактична програма с дородова диагностика. Това означава, че след приключване на предварителните анализите Лабораторията може да изследва плода при всяка следваща бременност и да установи рискът за раждане на дете с муковисцидоза. Дородовата диагностика се провеждат между 10 - 14 гестационна седмица или между 16-19 гестационна седмица.

Мускулната дистрофия Дюшен / Бекер (DMD/BMD) [OMIM, GeneTests] е най-честото невромускулно заболяване унаследяващо се по Х-срързан рецесивен начин. Засяга 1: 3 500 живородени момчета. Най-честите мутации са големи делеции (най-малко един екзон) в дистрофиновия ген, причиняващи 60-70% от случаите на болни. В около 10% от пациентите генетичния дефект е дупликация и 1/3 от случаите се дължат на точкови мутации. Напоследък повече от 200 различни точкови мутации по протежение на дистрофиновия ген са били определени.

• Методи за мутационен анализ [GeneTests]

Беше направен делеционен скрининг чрез мултиплетни амплификации на 18 екзона (3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52 и 60) в „горещи” делеционни участъци на дистрофиновия ген. Делеционните точки бяха определени прецизно чрез амплификация на допълнителни генни фрагменти. Тридесет и два случая от група пациенти с неизвестен молекулярен дефект бяха тествани чрез SSCP анализ за точкови мутации. До сега бяха проверени 29 екзона (29.1% от кодидиращата секвенция).

• Молекулярни характеристики при българските пациенти

Делеции в DMD гена са били детектирани в 90 неродствени пациенти (63.4%). Само 9 делеционни точки не бяха прецизно определени. Бяха определени точкови мутации в 3 DMD пациенти. Резултатите са представени в таблицата по-долу:

N	Мутация	No на хромозомите	Честота %
1	Делеции	90	63.4
2	Точкови мутации -exon 16 2183G-->T (Nonsense) -exon 41 6053delC (Frame-shift) -exon 54 8169A-->G (Missense)	3/32 1/32 1/32 1/32	9.3 3.1 3.1 3.1
3	Неизвестна	49	34.5

Размера, локализацията и характеристиките на делециите в проби от български пациенти са доста различни от публикуваните данни за други популации. Широки вариации в честотата на интрагенните дистрофинови делеции бяха забелязани между различните популации, като най-ниския процент (37%) беше съобщен в проба от Израел и най-високия (69%) в Шотландия. Получените резултати от български пациенти (63.4%) бяха близки до тези на гръцките пациенти (63.3%) и различни от тези, съобщени за други съседни популации: Турция - 55%, Кипър – 56.4% [Kiriakides et al., лично съобщение].
Разпределението на делеционните точки по интрони за българските пациенти беше определено и резултатите бяха доста различни от това, което е било съобщено за (средната / общата) Европейска популация. Има висока концентрация от точки на счупване в интрон 50 и относително прекъсване на точки на счупване в интрон 44. Наличието на горещи точки за делеции в рамките на интрон 50 изглежда да бъде обща характеристика в извадките от проби на пациенти от Балканския регион. Това беше определено също за гръцката, турската [Тодорова и съавт., 1996] и кипърската извадка от пациенти, както и за групата пациенти от Израел и Финландия.
Скрининга за точкови мутации в групата на българските DMD/BMD пациенти откри три мутации, делеция на нуклеотид С с изместване на рамката на четене, едно безсмеслено и едно погрешно замествания, които не са били публикувани преди. Литературните данни относно точковите мутации по дължината на дистрофиновия ген са много ограничени за сега и популационни различия на техния тип и разпространение не магат да бъдат направени.
Безмисленото заместване в екзон 16 причинява много тежък DMD фенотип с ранна дегенерация, бърза прогресия и смърт на 17г. възраст. Майката на това момче, не е носител на мутацията, подсказвайки че мутацията се е появила де ново. Делецията с изместване на рамката на четене в екзон 41 е унаследена от майката на пациента. Момчето е твърде малко за да бъде клинично оценено. Мутацията на погрешно заместване в екзон 54 е също унаследена от майката на пациента, но за момента не е възможно да бъде определено дали това заболяване е причинено от тази мутация или от полиморфизма по протежение на екзона. Всички точкови мутации открити в извадката от български пациенти не са били публикувани преди в литературата.
Напоследък всички DMD/BMD пациенти без делеции или точкови мутации в дистрофиновия ген бяха проверени за мутации в калпаин 3 гена (LGMD 2A, CAPN3). Нашите резултати показват, че в 3 от 58 DMD/BMD семейства (5.2%) прецизната клинична диагноза е калпаинопатия.

Фенилкетонурията (ФКУ) [OMIM, GeneTests] е най-често срещаното нарушение от наследствените метаболитни заболявания (1 : 10 000, 1: 15 000 в Европа). Генът за фенилаланин хидраксилаза (РНА) е бил клониран и характеризиран от Kwok и съавтори. Най-често срещаната мутация причиняваща класическа ФКУ при кавказката раса е сплайсинг дефект в интрон 12, водещ до аминокиселинна замяна в кодон 408. Последни проучвания доказват, че молекулната основа на ФКУ е хетерогенна и и включва повече от 400 различни мутации.

• Методи за мутационен анализ [GeneTests]

Скрининг за най-често срещаните в РНА гена чрез PCR и дот блот ASO хибридизация. PCR амплификация и директно секвениаране се използват за определяне на редки мутацтии.

• Молекулярни характеристики при българските пациенти

У нас са намерени 16 мутации при пациенти с класическа ФКУ. Три от тези мутации (R408W, IVS10nt546, R261Q) са намерени в 60% от пациентите. В 20% типът на мутацията не е определен.
Заедно с анализите на рискови семейства с ФКУ, у нас се провежда програма за масов неонатален скрининг. В България до сега 2 милиона новородени са изследвани за ФКУ. Общата честота на класическа ФКУ при българи е около 1 : 45 000, при турци 1 : 7000 и при роми 1 : 30 000.

Честотата на трансферазна недостатъчност е 1 : 84 000. Честотата на киназна недостатъчност е 1 : 5000 – 2000 (тези данни се отнасят до ромската популация).

Спиналната мускулна атрофия (СМА) [OMIM, GeneTests] е второто най-често срещано автозомно рецесивно нарушение и второто най-често нервно мускулно заболяване представено в три типа. Най-тежкият тип (болест на Werdnig – Hoffman) е честа причина за смърт в детска възраст. Генът причиняващ заболяването SMN (Survival Motor Neurone) е локализиран на 5q13.11 и съществува в две високо хомоложни копия – теломерно и центромерно. Теломерният SMN (SMNtel) е хомозиготно липсващ в 90 – 98% от пациентите на всички три типа заболяване, докато в останалите пациенти са били намерени няколко точкови мутации. Фенотипа на заболяването може да бъде модифициран от заобикалящи гени в районите, както SMNcen или NAIP гена. NAIP гена е представен в няколко, най-малко в 1 цяло копие. Хомозиготните делеции на екзони 5 и 6 от цялото копие са били съобщени в 50 – 100% от пациентите (главно с тип I СМА) в различни популации.

• Методи за мутационен анализ [GeneTests]

Генетичните анализи в семейства със СМА включват делеционен/мутационен скрининг на SMN и NAIP гени. Анализът на екзони 7 и 8 на SMN гена беше направен чрез нерадиоактивен SSCP анализ със сребърно оцветяване и / или рестрикционно рязане. Делезии на екзони 5 и 6 на NAIP гена бяха определени чрез мултиплетна PCR реакция.

• Молекулярни характеристики на български пациенти

Резултатите от мутационния скрининг в български семейства със СМА е показан в таблицата:

Хомозиготни делеции	СМА тип I	СМА тип II	СМА тип III
SMNtel - Exon 7 - Exon 8	95% 95% 95%	79% 92% 79%	65% 71% 65%
NAIP	40%	8%	6%

Генът, причиняващ СМА (SMNtel) е хомозиготно делетиран в 84% от българските пациенти. Този дефект беше определен в 95% от засегнатите със СМА тип І и само в 65% със СМА тип ІІІ. Наблюдаваната честота варира в границата 92-100% за тип І, 82-100% за тип ІІ и 78-100% за тип ІІІ. Тези несъответствия могат частично да се дължат на различията в генетичните характеристики на нашата група сравнени с публикуваните данни за други популации. До този момент мутационен скриниг в горещи точки на екзони 3 и 6 не показват мутации в non-deleated пациенти (данните не са представени).
В 6 пациенти (3 със СМАІІ и 3 със СМА ІІІ) бяха открити само делеции на екзон 7 на SMNtel гена. Методът на Hahnen (1997) на двустепенен PCR показа съществуването на хибриден SMNtel – SMNcen. Нашаите резултати са в съгласие с публикуваните данни за високата честота на хибридни гени в пациенти с хронични СМА форми.
Честотата на NAIP генни делеции е също между най-ниските, които са публикувани. Наблюдаван е техния фенотип. Генетичните анализи на тези гени дават само допълнителна информация в диагностиката на тежките СМА.